1、连接体系中T载体和PCR片段的含量

一般市场上各种T载体包装浓度约为50ng/ul。常规3kb左右的T载体在连接体系中加入总量为50ng-100ng，载体和片段摩尔比一般为1 ：3。比如，一个100bp片段连接到3kb的T载体中，T载体加入量60ng，则100bp片段应该为60ng。

2、PCR片段的质量

连接体系中PCR片段的质量对连接成败起着关键作用。

（1）PCR片段的长度不同对连接的要求也不同，过长或是较短的PCR片段需要调整连接体系；

（2）PCR片段的纯度和特异性要较高；

（3）回收后的PCR片段浓度要合适，特别是长度较长的片段，浓度不能过低，PCR产物做胶回收会降低片段浓度。

3、 平板没有菌斑或是很少

收到T载体后，一般要-20℃保存。如果短期内不能使用完，建议将载体分装保存。在室温或是4℃放置过久，T载体会出现末端T丢失，载体降解等情况。

平板没有菌斑或是很少，除T载体损坏外，其它原因有：

（1）连接体系中的连接酶及Buffer；

（2）末端含A的PCR片段质量，包括纯度、浓度以及特异性；

（3）感受态细胞的质量。

4、 连接长度较短的PCR片段时，会出现菌斑过多，或是过少的情况

在同样总量的情况下，DNA片段长度越短，其摩尔数就会越多，这也是许多小的PCR片段容易连接，长出更多菌斑的原因。如果DNA片段摩尔数过多，就会竞争结合有限的T载体，导致连接效率降低，反而会使菌斑降低。所以，对于连接该类片段时，其摩尔数不能过多。

5、连接长度较长的PCR片段时，常会出现菌斑较少或不长斑等情况

常规连接时，当PCR片段长度大于2kb时，一般菌斑就会出现下降趋势。PCR片段长度越大，菌斑就会越少。

可以通过以下方法调试：

（1）延长连接时间；

（2）提高载体和片段的质量，比如，片段要为特异性单一条带，片段不能有降解趋势，载体和片段的纯度和浓度要高；

（3）可以尝试调整载体和片段摩尔比，比如调整为1 ：1等。