1、HIS标签蛋白洗脱后杂带较多,什么原因? 如何优化？

高纯度的蛋白是纯化工作者的追求，但是由于很多天然的蛋白也会带有HIS，所以经常会出现HIS标签蛋白洗脱后有一些杂带，可能的原因和优化的方法如下：

• 可能原因：蛋白酶部分降解了标签蛋白

策略：请添加蛋白酶抑制剂，(慎用EDTA)。 

• 可能原因：杂质对镍离子有更高的亲和性

策略1：咪唑浓度必须优化，以确保高纯度（宿主细胞蛋白质的低结合）和高产率（组氨酸标记的目标蛋白质的强结合）之间的最佳平衡。分步或者线性洗脱摸索出最优的咪唑结合和清洗浓度；在样品中加入与结合缓冲液同样浓度的咪唑；咪唑的梯度不大（20 个或更多的柱床体积），可能分离出有相似结合强度的蛋白。

策略2：筛选最适合的缓冲液条件，NaCl浓度，pH的范围都需要进行筛选以下是（His）6-NuRR1蛋白在His MultiTrapFF96孔板上进行缓冲液条件的筛选以便决定最适的结合和洗脱条件。对于单一目标蛋白在进行缓冲液筛选时，将缓冲液、盐、甘油和还原剂设计成96个不同的混合配方。实验结果显示对于该目标蛋白25mMTris，10mMNaCl，10％甘油，pH8.5的缓冲液适最佳的结合条件。

策略3：若以上优化的条件都不能去除杂质蛋白，需要考虑多步纯化的思路，离子交换（HiTrap Q HP or HiTrap SPHP） 和凝胶过滤（Superdex™Peptide，Superdex 75 or Superdex200）是必须的.以下是用ÄKTAxpress仪器进行四步纯化的实例。AC（亲和），DS（脱盐），IEX（离子交换），GF（凝胶过滤）所有的步骤都在ÄKTAxpress上自动执行,包括柱上的标签酶切。

• 可能原因：杂质和标签蛋白结合在一起

策略：在超声破碎细胞之前加入去垢剂或者还原剂；增加去垢剂的浓度，（ 2 % Triton X-100 or 2 % Tween 20）；或者在wash buffer中增加甘油的浓度(50%)减少非特异性的相互反应；考虑增加咪唑的浓度或者改变金属离子。

• 可能原因：洗涤不充分

策略：增加洗涤的次数,使洗涤充分。

2、对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的抗体样品，有哪些样品处理的方法？

在纯化前，合适的样品处理不仅可以帮助我们得到高纯度高质量的抗体,还有助于保护亲和层析柱，延长使用寿命。对于血清、腹水或细胞悬浮物来源的样品经常含有脂蛋白，酚红，小分子污染物等等。 腹水中经常含有高浓度的脂蛋白，这些脂蛋白和脂类物质会堵塞层析柱，最好能在纯化之前去除。方法一是在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去；方法二PVP能产生一个pH值依赖的沉淀效应，PVP在pH＝7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白。很多时候，可以考虑进样前用亲和结合缓冲液稀释腹水，不仅保证样品的结合pH，还有利于降低黏度。 酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂，虽然并不直接的影响纯化，但是酚红可能结合到某些纯化介质上，应该尽可能早的被除去，可以使用脱盐柱除去酚红。 对于一些低分子污染物可以使用分级沉淀法去除，如硫酸铵沉淀，羊脂酸沉淀的方法。 最后利用脱盐柱来更换缓冲液并除盐，，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子。

3、为什么洗脱之后没有看到正确的条带？

首先我们先看样品是否结合了？先查不同的种属亚型参考“相对结合强度”表（图1），看有没有亲和性，柱子选得对不对。然后检查结合缓冲液和样品的pH是否7.3附近。必要时将原始样品和流穿跑还原和非还原SDS-PAGE进行分析，有条件可以做Western Blot，或检测Elisa是结合上去没有洗脱？

检查洗脱缓冲液pH对否？

建议依次用pH3.0, pH 2.5, pH 2.0洗脱，跑电泳或ELisa等检测洗脱产物

洗脱峰是否立即中和？

蛋白长期在酸性条件下易水解，中和后也容易产生沉淀

跑电泳的loading buffer是否新鲜配置？（常遇到还原loading buffer中DTT失效，导致电泳条带位置不对）