1、如何选用特殊细胞系培养基？ 

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 

2、 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ 

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 

3、GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ 

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。 

GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 

4、什么培养基中可以省去加酚红？ 

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 

5、如何用台盼兰计数活细胞？ 

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个毫升，在0.1毫升的细胞悬液中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。 

6、 如何消除组织培养的污染？ 

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。 

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。

下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。 

（1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。 

（2） 分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mgml。 

（3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。 

（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。 

（5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。 

（6） 重复步骤4。 

（7） 在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。 

7、 培养基中丙酮酸钠的作用是什么？ 

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 

目录上说，Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ 

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2gL)中比在Hanks (0.35gL) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 

8、 二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？ 

二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。 

我试用SF900 II时，细胞生长良好，但是我的蛋白产物不如使用Graces 液和10%胎牛血清时效果好。 

如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。 

9、 20°C下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下PH值会改变吗？ 

对于普通使用的缓冲液，PH值随温度变化而变化。 

下表列出温度改变10℃时，PH值的变化情况： 

例如 20℃下配制PH7.4 Tris缓冲液,40℃时PH值为 7.4-(2x0.310)＝6.78 

10、 室温下(25)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用时PH值是多少？ 

缓冲液的PH值随温度变化而变化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的PH值。 

11、昆虫细胞培养的最适PH值和渗透压是多少？ 

生长培养基的PH值对细胞的增殖和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在PH值 6.0～6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最适渗透压是345-380mOsmkg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持PH值和渗透压在以上所列的范围之内。 

12、High Five细胞有任何其它名称吗？ 

High Five细胞也被称为Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。 

PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别 

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM既是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。 

13、在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ 

High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 gL Tween-80，1.0 gL Pluronic Poly-all。 

14、High Five细胞用多大的密度冻存？ 

3.0x10E6 cellsml。 

15、在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？ 

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。 

16、 如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？ 

我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴斯德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 

胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：

（1）去除培养基。 

（2）用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。 

（3）加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。 

（4）37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。 

（5） 向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。） 

（6）离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。 

（7）用新的培养基重新悬浮细胞。传代。 

17、 在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？ 

为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位毫升细胞悬液。 

在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？ 

通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候计数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。 

Tech tips 

贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，可能在放置几天后颜色变紫。这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。 

如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。 

当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。 

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 

总之，大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。 

在进行传代培养时，我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。研究者常常通过一个简单的稀释（1∶4或1∶2）进行传代，不进行活性检测，您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞，这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。 

在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。